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WB

2022-07-07 11 min read # Protocol

Western blotting

REAGENT SOURCE IDENTIFIER
PBS缓冲液粉末 Gene Tech（shanghai） 货号 GT100102
Tris-base INNOCHEM B54909-800G
1M Tris-Cl Leagene R00214
甘氨酸 Sangon Biotech CAS 56-40-6
SDS Sangon Biotech CAS 151-21-3
Sodium cloride(NaCl) TongGuang Chemistry(Beijing) CAS 7647-14-5
β-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific Cat M8210
RIPA裂解缓冲液加强型 Applygen Technologies Inc. 货号 C1053+
HaltTM Pretease Inhibitor cocktail Thermo Scientific Prod 1862209
Phosphatase Inhibitor cocktail Tablets Roche REF 04906837001
PierceTM BCA Protein Assay kit Thermo Scientific REF 23225
5x Protein Loading buffer Coolaber SL1180-10ml
SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒 Biotides WB1101(7.5%) WB1102(10%)
叠氮化钠 邓老师从北大带回来的
Tween-20
M5 Prestained Plus Protein Ladder(10-250kDa) with 40kDa Mei5 biotechnology Cat MF028-plus-01
EZ-Buffers F 5X Ponceau S Staining Solution Sangon Biotech C520005
Difco Skim milk BD REF 232100
M5 Western Blot 封闭液(BSA based) Mei5 biotechnology Cat MF432-01
各种一抗
GAPDH Mouse Monoclonal Antibody Sungene Biotech Cat KM9002
Beta-actin
HIF-1a Rabbit mAb (clone: D1S7W) Cell signaling 36169S
p-Perk
Perk
ATF4
HRP-Anti-Rabbit IgG Cell signaling 7074S
HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L) Biodragon Cat BF03001
NC膜 Millipore HATF00010
转膜用滤纸(100X75X1mm) Biotides Cat WB1701
增强型ECL化学发光试剂盒 Biodragon BF06053-50

  1. 实验步骤

  2. 样品制备

（以收取hypoxia刺激的T细胞为例）

  1. 收细胞：打冰，预冷两台低温离心机。

将细胞吹打悬浮后转移入15ml离心管，加入约5ml预冷PBS洗涤培养皿一次后转入同一离心管中，4度300g离心5min。离心后弃上清，加入5-10ml预冷PBS重悬，4度300g离心5min以洗去残留FBS。离心完成后弃上清，加入1ml预冷PBS重悬后转移至1.5ml离心管中，在小型低温离心机中4度8000rpm离心2min(300g离心力相当于1800rpm，但经验表明小型低温离心机该离心力离心效率低)，依次用1ml与200ul枪将上清尽量吸干净，可直接用于裂解或者尽快置于-80度冰箱保存。

  1. 裂解：

将细胞置于冰上，加入适量裂解液将细胞沉淀重悬(根据经验，10million的T细胞，加入30ul裂解液，hypoxia培养1d样浓度为500ng/ul左右，3d样为1000ng/ul左右，5d样为700ng/ul左右；肿瘤细胞样建议加入约5倍细胞沉淀的体积，或者参考裂解液说明书的建议：106细胞加20ul；107细胞加100ul)，冰上裂解30min(期间可震荡几次)后，小型低温离心机4度12000rpm离心5-10min。离心完成后小心地吸取上清，转移至新的1.5ml离心管中，即为蛋白样品。

  1. 定量：BCA法，以12.5ul样品：100ul工作液/孔为反应体系。

首先按孔数以A液：B液=50:1的比例配制好工作液，然后以2倍梯度稀释法配制标准曲线孔，共6孔(如下表：1-5孔加12.5ul ddH2O, 6孔加25ul 标准白蛋白样Alb, 2000ng/ul, 然后从第6孔取12.5ul加入5孔混匀，再从第5孔取12.5ul加入4孔混匀，重复操作，直至从第2孔取12.5ul弃置。则配成了1-6孔蛋白浓度分别为0,125,250,500,1000,2000ng/ul的标准浓度蛋白样)，在对应样品孔加入12.5ul蛋白样品，最后加入100ul工作液，将96孔板放置于37度孵箱30min。

孵育完成后，室温放置一小会以回复室温，拿下5楼利用酶标仪测562nm处的吸光度，再依标曲计算出样品浓度(虽然有不少实验室的师兄师姐为了方便而反复利用以前的标准曲线，但据实验经验，每次标曲都会与之前的有所差别，因而还是推荐每次定量都做一次标曲)

1 2 3 4 5 6
12.5ul ddH2O 12.5ul ddH2O 12.5ul ddH2O 12.5ul ddH2O 12.5ul ddH2O 25ulAlb
  1. 变性：

从各样品中取等体积蛋白样于新的1.5ml EP管中，加入5X Loading buffer，沸水煮5-10min，冰上放置5min后，离心，可置于-80度冰箱保存或者根据定量结果配平后上样。

  1. 电泳电转

  2. 配胶：以一块0.75/1.0/1.5mm的mini胶为例。

配下层胶时取缓冲液与溶液(室温保存)各2.0/2.7/4.0ml，再加入40/60/80ul 改良型过硫酸铵溶液(保存于4度)混匀后倒入制胶玻璃板中，加入2ml异丙醇/乙醇压胶，20-30min凝固。

配上层胶时取缓冲液与溶液(室温保存)各0.5/0.85/1.0ml，再加入10/15/20ul 改良型过硫酸铵溶液(保存于4度)混匀后倒入制胶玻璃板中，小心插入梳子，避免产生气泡，20-30min凝固。

可置于4度冰箱保存数天或者直接用于跑胶，推荐现配现用。

  1. 上样跑胶：

Marker推荐上5-10ul。以1mm厚的胶为例，15泳道建议上样15ul，不要超过20ul；11泳道建议上样量20-30ul，不要超过40ul。

积层胶跑80V，分离胶跑120V，约2-3h。

  1. 转膜

大于100kDa的蛋白建议用湿转，小于100kDa的蛋白建议用半干转。

半干转：200mA恒流30-60min。湿转：300mA恒流90min-150min

  1. 敷抗体

  2. 封闭：

含5%脱脂奶粉的0.02% PBST摇床1h，用0.02% PBST洗膜3次，每次5min。若为磷酸化蛋白，推荐使用5%的BSA封闭液封闭(下面配抗体也应用BSA配制)，洗膜推荐使用TBST。（封闭完后移动至相应一抗小室来敷抗体）

  1. 一抗：

含5%脱脂奶粉的0.02% PBST配制一抗，内参抗体常1:5000稀释，其他蛋白抗体常1:1000稀释，加入终浓度为0.02%的叠氮化钠后可保存于4度重复利用几次（因邓老师认为保存于-20度会因反复冻融而降低抗体效价，所以不保存于-20度）。内参抗体室温摇床1h，其他蛋白抗体建议4度摇床过夜，用0.02% PBST/TBST洗膜3次，每次5min。

  1. 二抗：

含5%脱脂奶粉的0.02% PBST配制HRP偶联二抗，按1:10000稀释，因叠氮化钠会灭活HRP，因而不重复使用。室温摇床1h，用0.02% PBST/TBST洗膜3次，每次5min。

  1. 发光：

按1液：2液=1：1的比例配制发光液，一张剪切后的膜需要200-300ul发光液，现配现用。打开计算机及成像仪器，因成像仪器的CDD摄像机需要3min左右冷却至-30度后才能使用，因而推荐在二抗敷完后第三次洗膜时配发光液及开仪器。

一定要先开成像仪器再打开“WB auto”软件，否则成像仪器的白光灯可能会无法正常打开。

将膜置于成像台中间，选择”预览”来确定膜的位置无误后停止预览；将发光液均匀地滴在膜上，室温孵育1-2min后，选择“化学发光”模式，先“自动曝光”，看看曝光效果，根据需要手动调整曝光时间重新进行曝光；选择“白光”模式，曝光50ms拍摄背景帧，右键单击背景帧，“使用当前图片作为背景”，然后单击化学发光帧，观察条带。

如果出现背景过高、发光液反光等现象，建议将膜上发光液除去后再重新依上面步骤曝光。

点击“另存”可保存当前图片。

  1. 洗脱

当需要在同一张膜上观察大小相差不大的目的蛋白时，可以洗脱掉一抗二抗再敷新的抗体。

加入5ml stripping buffer，室温摇床15min（但大多数protocol均推荐50度5-10min。可以先50度预热好stripping buffer然后摇床10min），用0.02% PBST/TBST洗膜3次，每次5min。（可适当增加洗膜次数或延长洗膜时间以去除残留的巯基乙醇）。

  1. 重复封闭-发光的步骤。

  2. 注意事项

  3. 为最大化转膜效率，转膜液pH应不小于8.0，且SDS浓度不能大于0.1。

  4. 浓度与线性分离范围

丙烯酰胺浓度/% 线性分离范围/kDa
15 10-43
12 12-60
10 20-80
7.5 36-94
5.0 57-212

此数据为双丙烯酰胺:丙烯酰胺=1:29条件下的数据。

  1. 溶液配制

除标注外，以下配方均来自《分子克隆实验指南》

  1. Tris-glycine电泳缓冲液**(10X, pH8.3, 1L)**
试剂 所需量 浓度
Tris-碱 30.3g 250mmol/L
甘氨酸 144g 1.92mol/L
SDS 10g 1%(m/V)

用100ml水溶解，继续加水至800ml左右，用HCl调pH=8.3后再加水至1L。（目前不调pH）

  1. TBST****洗涤缓冲液（1X, 1L）
Tris-Cl(1mol/L, pH7.4) 10ml 10mmol/L
NaCl 9g 0.9%(m/V)
吐温20 200ul 0.02%
  1. 半干式转膜缓冲液（10X, 1L）
试剂 所需量 浓度
Tris-碱 29.1g 240mmol/L
甘氨酸 144g 1.92mol/L

10X溶液常温保存。

20%甲醇在稀释至1X时加，加后放4度保存。

  1. 浸入式转膜缓冲液**(10X, 1L)**
试剂 所需量 浓度
Tris-碱 29.1g 240mmol/L
甘氨酸 29.25g 390mmol/L
SDS 0.375g 0.375%

10X溶液常温保存。

20%甲醇在稀释至1X时加，加后放4度保存（SDS也可在稀释时加，终浓度不应超过0.1%. 目前实验室并不加SDS）。

  1. 100ml Stripping Buffer
试剂 所需量 浓度
10% SDS 20ml 2%
1M Tris-HCl 6.25ml 62.5mmol/L
Beta-Mercaptoethanol(14.2mol/l) 0.8ml(under the fumehood) 114.3mmol/L

该配方来自Abcom官网，[https://www.abcam.cn/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol?utm_source=Eloqua&utm_medium=Email&utm_campaign=Western%20blot%7cN%2FA%7c42948%7cN%2FA%7cN%2FA%7cEng%7cAutomated%20-%20Nurture&utm_content=Email3.1%7c&mi_u=1067221](https://www.abcam.cn/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol?utm_source=Eloqua&utm_medium=Email&utm_campaign=Western blot|N%2FA|42948|N%2FA|N%2FA|Eng|Automated - Nurture&utm_content=Email3.1|&mi_u=1067221)

《分子克隆实验指南》中的配方巯基乙醇推荐使用0.7ml，终浓度为100mmol/L。

温和再生处理

温和stripping缓冲液，1 L

15 g 甘氨酸

1 g SDS

10 mL Tween 20

溶于 800 mL 蒸馏水中

调整 pH 至 2.2

加蒸馏水至 1 L

  1. 用能覆盖膜的缓冲液在室温下孵育 5–10 分钟。
  2. 弃去缓冲液
  3. 用新配制的膜再生缓冲液重新孵育 5-10 分钟
  4. 弃去缓冲液
  5. 在 PBS 中洗涤 10 分钟
  6. 在 PBS 中洗涤 10 分钟
  7. 在 TBST 中洗涤 5 分钟
  8. 在 TBST 中洗涤 5 分钟
  9. 可用于封闭
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