Lum's Notes

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Transfection and Transduction，plat-E/MSCV

2022-07-07 21 min read # Protocol

材料准备

  1. T cell media:

    1. 500ml DMEM
    2. 5ml glutamax
    3. 5ml P/S
    4. 4ul mercaptoethanol
    5. 50ml sterile FCS

  3. Transfection media:

    1. 500ml RPMI
    2. 5ml glutamax谷氨酰胺
    3. 4ul mercaptomethanol 巯基乙醇

  5. Complete RPMI (RPMI is better than DMEM for better viral stability):

    1. 500ml RPMI
    2. 5ml glutamax
    3. 5ml P/S
    4. 4ul mercaptoethanol
    5. 50ml sterile FCS

  7. Freezing media:

    1. 90% sterile heat inactivated FCS
    2. 10% sterile DMSO
试剂名称 规格 厂家 商品号
DMEM
Opti-MEM 50ml
泰乐菌素 1g 工作浓度10ug/ml
Lipo2000
Polybrene
  1. opti-MEM 逆转录病毒包装需要用200ul
  2. 泰乐菌素母液50ug/ml,杀支原体用1000x，培养用 5000x

转染前五天

A) 解冻复苏冻存的细胞（这一步可以不用做）

  1. 取出液氮冻存的细胞
  2. 37度水浴解冻，直到细胞融化一半。
  3. 将冻存管置于冰上.
  4. 打开盖子，用习惯吸出细胞悬液，将细胞转移到装有10ml cDMEM的15ml锥形管中（冲洗冻存管和盖子以回收所有细胞）。
  5. 离心，1300rpm, 5分钟, 4度
  6. 弃去上清液，加入培养液重悬细胞，将细胞转移到另一个10ml cDMEM的15ml锥形管中。计数，调整细胞密度。

B) 培养皿接种

  • 将细胞转移至100mm x 20mm培养皿后，加入5ml cDMEM 。置于37度，10% CO2的培养箱中复苏。

注意：冷冻越慢越好，复苏越快越好。

不要频繁看细胞

不要怕消化，吹打对细胞的损伤比消化更大

传代方法2-3天换液一次 冻存条件：看细胞说明书

支原体：黑色多形，一般培养也会浑浊。支原体感染用泰乐菌素，无不良反应，工作浓度8ug/ml.

刚刚复苏的细胞非常脆弱。需要我们的细心呵护。培养液要事先在培养箱或者水浴中复温。一切的和细胞接触的动作都要轻柔。把细胞从冻存管里吸出来，注入离心管，要轻轻地吸取和滴加。包括给离心管补加培养液的时候，都要轻轻地滴加。离心要用低速离心（500-1000转/分钟）。吹打要用专用的吹打管，而不要图方便用移液枪，吹打也要轻轻的。

DMSO是有毒致癌的，取细胞记得戴手套。

做好标记：名字，细胞名称，代数（f4），日期。

除了极少数特别注明的对DMSO敏感的细胞外，99%的细胞都不需要去除DMSO。解冻后的频繁换液会慢慢去除掉DMSO的。

转染前第四天

  1. 24小时之后观察，确保细胞贴壁，细胞融合度达到70-80%时，将培养基吸出，换为新鲜的DMEM培养基补充营养，非贴壁的细胞要去除。
  2. 三天后这些细胞将扩增到25x106/dish。细胞在25x106/15cm2 dish细胞贴壁完全舒展。

转染前两天

  1. 镜下查看细胞。 如果细胞拥挤或细胞融合度高，1:2传代到两个培养皿中。

转染前一天

  1. 逆转录病毒包装细胞系plat-E细胞消化后计数，以1.5x10^5细胞每孔铺于6孔板，培养基体积为1.5ml。CO2培养箱37℃过夜使细胞贴壁。

  2. 剩下的不需要转染的细胞（指plat-E细胞），将它们传代培养，这样它们就可以存活了。 为了使细胞延续培养,可将细胞传代于:

    1. 1.5x106/15cm2 dish in 30mls medium/dish 或
    2. 1 x106/10cm2dish in 20 mls media.

    • 传代**😗*

      • 用PBS轻轻冲洗细胞，并将其传代到新鲜培养基中(按上述密度在10cm或15cm板上)。.
      • 为了保证培养细胞的均匀性和减少克隆变异，建议细胞不要以大于1:5的稀释浓度传代。不能让细胞过度融合，因为这会导致培养中细胞团块的形成，导致增殖后细胞分布不均，转染效率降低。
      • Phoenix cells 对传代很敏感; 在分裂早期冻存一小份, 如果转染效率下降，则取出冷冻的细胞（继续传代转染）。

  • 冻存**😗*

    • 用PBS冲洗细胞
    • 500 xg 离心 5 min
    • 细胞计数
    • 弃去培养基，每10^6 细胞加入1ml冻存培养基. 转移到2ml冻存管中
    • 冻存管放置在 -80 °C 过夜
    • 第二天转移到液氮中

转染****A

PART A: 逆转录病毒的包装

  • (不要糊弄——只需要在转染前五天的未经处理的plat-E细胞中取几毫升上清液). 尽量使用MSCV空载体质粒对照。

    1. 空载体质粒 (Ngfr) = control
    2. 构建=(突变体)

细胞贴壁、细胞融合度达到70-80%时，将培养基吸出，换为37℃预热的新鲜的DMEM培养基（转染培养基）。重新放回37℃培养箱孵育1h.

•注意:加入培养基时，枪头尖端轻触培养皿侧面，慢慢加液，以免细胞脱落。

  • 将4ug的逆转录病毒质粒及1ug的病毒包装质粒加入100ul的opti-MEM培养基中吹匀
  • 另取10ul的转染试剂lipofectamine 2000,同样加入100ul opti-MEM中轻轻吹匀。将110ul Liop2000+105ul混合质粒轻柔地混合均匀，常温孵育5min。
  • 将混合好的 DNA & Lipo2000 轻柔地加入六孔板的一个孔中,全部样品体系加完之后轻轻晃动，彻底混匀，常温孵育4h。
  • 转染4h之后可以更换新鲜培养基，或者第二天变黄时更换新鲜培养基。

转染****B

PART B: 获取CD4+ T细胞

  • 安乐死小鼠，取小鼠的脾和淋巴结

  • 处理成单细胞悬液

  • 阴性选择分离大量的CD4+T细胞或通过分选纯化出naïve CD4 cells

    1. ONLY IF NEEDED: 当使用阴性选择时，一轮选择就足够了. 每只小鼠理论上得到 10-15 x106 cells同时 CD8/B cell 消耗良好.

  • 流式分析CD4+ T cells 纯度. 也可以染色，固定一整夜，第二天检查纯度.

  • 铺板：制备含有PBS无菌培养液的anti CD3 和 anti CD28抗体包被的24孔板。用1x PBS将antiCD3抗体稀释至2ug/ml,将antiCD28抗体稀释到1ug/ml,混匀后加入到24板中，每孔300ul。水平晃匀后放入37℃培养箱中1-2h（或4℃冰箱，包被过夜）。 原文档：[aCD3 (2C11) 5ug/ml, aCD28 (37.51) 5ug/ml].

  • 重悬 CD4+ T cells ，调整浓度为1x106 cells/ml. [原文档：2x106 cells/ml]。将包被好的24孔板取出，吸掉PBS，迅速加入细胞，每孔加入1ml细胞。 (原文档：2ml of cells per well)

  • 每孔中加入正确体积的IL-2 . (将细胞置于一般体积的培养液中，加入2x的IL-2)（原文档：anti-IL-4 antibody and IL-2 cytokine）

    • Need 20ug/ml anti-IL-4. Stock is at 1mg/ml and so need 40ul for each well with 2mls of cells.
    • Need 50U/ml rhIL-2. Stock is at 50 000U/ml and so need 2ul for each well with 2mls of cells.

  • 将细胞放到 37 摄氏度, 10% CO2 培养箱活化细胞， 48小时后用于转染。

转染48h后

  1. 转染48h后，通过facs荧光观察转染效率，观察plat-E的细胞融合程度。
  2. 收集、计数CD4 细胞（48小时刺激后损失约50％）。用cRPMI重悬（以匹配病毒培养液），细胞密度为1x10^6/ mL。

病毒收集:

  1. 48h后轻柔地收集上清，使用0.45um滤器过滤或500xg 4℃离心5min(去除活细胞)，即为包装出的病毒悬浊液。
  2. 在培养皿剩下的platE细胞中加入等体积的温暖的cPRMI培养基，使他们在接下来的72小时中也继续制造病毒。
  • 如果在数小时之内需要使用逆转录病毒悬液，请放置在冰上。否则请冷冻逆转录病毒悬液。只要不超过一个冷冻/复苏周期，冷冻影响的病毒滴度损失就越小。 (不超过半数的损失).
  • 如果你想使用感染72小时的病毒，等72小时收病毒的时候保存10%的细胞，用于染色以检查转导效率.

PART****转导 CD4s :

  1. 加入2x Polybrene 和 2xIL-2 在装有T细胞(1x106/mL) 的试管重悬细胞。(2x 转导培养基), 每24孔板接种500ul细胞,然后每孔加500ul新鲜收获的病毒！

  • i.e:

    • 500uL virus (harvested day=today, centrifuged to remove cells)

    • 500uL cells ie total of 0.5x106 cells (in the 24 well plate!) with :

      1. 终浓度8ug/mL polybrene (Stock is at 4mg/mL and final well volume is 1mL)
      2. 终浓度50U/mL rhIL2 (stock 50,000U/ml and final well volume is 1mL)

  1. 等待离心机预热的时候放在37℃孵育

  2. 离心前用封口膜密封

  3. 将24孔板室温离心，1800rpm，40min（原文2000rpm for 45-90mins）

  4. 取出24孔板，置于10% CO2 37℃ 培养箱中孵育 4-6h。

  5. 4-6h后, 吸出病毒液并换上含有100u/ml rhIL-2的新鲜的1640培养基。 (原文用cIMDM****洗去病毒液).

  6. 细胞计数每孔1x106cells/ml，换上含有100u/ml的rhIL-2的新鲜的1640培养基，每孔50微升，在37℃培养72小时。 (no antiCD3/antiCD28) (去除多聚苯，使细胞达到良好的密度).

  7. 培养期间每24小时视情况分孔或更换新的培养基（Split every 24hrs!）

转导72小时之后

  1. 你也可以96小时之后再做
  2. 收获并计数T细胞
  3. 取一小份未处理的细胞和培养后的细胞，通过流式检查转染效率

删去了Th17极化、PCR、Elisa、ICS的内容。

小贴士**😗*

  1. 取决于载体/platE cells, 48小时和72小时病毒会产生不同的转导效率

  2. 您可以连续转染两天，选择产生病毒最佳的。(如果72小时的病毒更好, 请在转染后48小时收集处理小鼠CD4细胞以保证刺激48小时，但目前认为T细胞活化三天效果更好.

  3. 您也可以连续两次感染（每次两次，每次45分钟，除去500 ul培养基并加入500 ul收获的病毒悬液）

  4. 预期的小鼠细胞数 from Claire/Peter:

    • One mouse gives ~10e6 CD4+25-
    • O/N loss with PMA/IONO leaves ~5e6
    • 72h IL-2 (~3x+) expansion give ~15e6 (11-12)
    • lose some w/NGFR purification: down to ~12e6 (8-9)
    • lose more w/O/N rest unless decide to restim immediately
    • 一只老鼠可提供 ~10e6 可用的细胞 (5e6+ worst case)

  6. 关于RPMI与DMEM的说明：Wells实验室在所有步骤中都使用RPMI。 RPMI中的病毒颗粒可能更稳定，因此最终的病毒生产应在完整的RPMI中进行。转染可能可以在DMEM中完成。

RPMI 1640主要用于悬浮细胞培养。可适用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养。其它像K-562、HL-60、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。

DMEM适用于贴壁细胞生长，如各种实体瘤贴壁细胞。

IMDM(Iscove’s Modified Dubecco’s Medium ) 又称为伊思柯夫改良培养液。当初是为培养B 淋巴细胞设计的，当然也可以用于其它细胞。它含有更高浓度的营养成分，适合于高密度细胞培养，如制备抗 体时的杂交瘤细胞培养

含有L-谷氨酰胺4.00mM; HEPES缓冲液25mM；不含α-硫代甘油；不含碳酸氢钠；含酚红。

主要用于培养hybridoma cell lines ，macrophages，HUT78等细胞，并且这些IMDM培养的细胞同样也可以用RPMI-1640培养。

因为IMDM与RPMI-1640的差别也主要在于酚红和丙酮酸钠等成分的差别，比如，IMDM的酚红含量是RPMI-1640的3倍，并且其中含25mM HEPES和L-谷氨酰胺。

之所以使用1640和DMEM是因为这两种培养基比较大众化,价格也比较便宜.而IMDM可谓为豪华版培养基,价格为前两种的1.5倍(以hyclone)为准.一般而言,IMDM适合高密度细胞培养,如细胞工程,造血干细胞,血液细胞培养.实际上,IMDM也可以用来培养其它细胞,如成纤维细胞,肿瘤细胞,其收获量为大约为1640的2-3倍左右.

DMEM 肿瘤细胞

RPMI1640 淋巴细胞

IMDM 人的组织细胞。进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM

MEM 常用基础培养基

补充：

1.如何选用培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：

细胞系 细胞类型 种 组织 推荐使用的培养基

293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM 10% 热灭活马血清
3T6 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM 10% 胎牛血清
A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K 10%胎牛血清
A9 成纤维细胞 小鼠 结缔组织 DMEM 10%胎牛血清
AtT-20 上皮细胞 小鼠 垂体肿瘤 F-10 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纤维细胞 小鼠 胚胎 DMEM 10% 胎牛血清
BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾 GMEM 10% 胎牛血清 或MEM10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A 10% 胎牛血清
BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM 10% 胎牛血清和 NEAA
Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮细胞 小鼠 黑素瘤 F-10 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纤维细胞 猴 肾 DMEM 10% 胎牛血清
COS-3 成纤维细胞 猴 肾 DMEM 10% 胎牛血清
COS-7 成纤维细胞 猴 肾 DMEM 10% 胎牛血清
CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM 10% 胎牛血清
D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴细胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640 10% 胎牛血清
GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10 15% 马血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴细胞 人 T细胞淋巴瘤 RPMI-1640 20% 胎牛血清
HaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME 10% 小牛血清
HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640 10% 胎牛血清
HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension S-MEM)
HEp-2 上皮细胞 人 喉 癌 MEM 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴细胞 人 早幼粒细胞白血病 RPMI-1640 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy's 5A 10% 胎牛血清
HUVEC 内皮细胞 人 脐带 F-12K 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml
I-10 上皮细胞 小鼠 睾丸癌 F-10 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴细胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮细胞 人 绒毛膜癌 MEM 10% 胎牛血清
Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴细胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴细胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640 10% 胎牛血清
KB 上皮细胞 人 口腔癌 MEM 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白细胞 人 红白血病病人骨髓 IMDM 20% 胎牛血清
L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌细胞 DMEM 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 Medium 199 5% 马血清
McCoy 成纤维细胞 小鼠 未知 MEM 10% 胎牛血清
MCF7 上皮细胞 人 乳腺癌 MEM 10% 胎牛血清 NEAA 10ug/ml 胰岛素
WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病 DMEM 10% 胎牛血清
WI-38 上皮细胞 人 胚胎肺 BME 10% 胎牛血清
WISH 上皮细胞 人 羊膜 BME 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮肤 MEM 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮细胞 小鼠 肾上腺瘤 F-10 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清

2.为什么要热灭活血清？

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红？

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞？

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染？

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？

GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。

10.目录上说，Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？

Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌体检验

生物化学检测

激素的检测

血红蛋白检测

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