RNA extraction and RT-PCR protocol

实验前的准备

用超净台,用之前开紫外照射,把RNAase free水,需要管,大中小枪头,镊子,和板子。

放入超净台,不吹风,用镊子装枪头,摆EP管。

3大步:裂解Trizol 萃取CHCL3 (氯仿) 沉淀异丙醇

第一步 RNA的提取

  1. 从液氮中取出组织后,快速的拿到超净台上,放入小皿中,加入trizol试剂,(100mg的组织放入1.2ml的trizol试剂),用注射器进行研磨,注意要熟练,快速研磨。(下面加的试剂按照1ml trizol的比例添加即可)。
  2. 细胞或组织加入Trizol研磨后,15~30℃孵育15min,使其充分裂解。(此时如果不接着做下面的实验可以冻存于-80℃低温冰箱)。
  3. 4℃,12000转,离心5min ,弃沉淀。(超净台准备好EP管,离心后,吸取上清至准备好的EP管中)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,剧烈振荡15s,(用手震荡即可)1530℃孵育23min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。(氯仿又叫三氯甲烷chloroform,一般储存在4℃冰箱中)。
  4. 4℃,12000转,离心15min。吸取上层水相,至另一离心管中。注:(1)吸取水相要小心,千万不要吸取中间界面。可采用小枪头少量多次吸取(2)若同时提取DNA和蛋白质,则保存下层有机相,存于4℃冰箱内备用,否则弃下层有机相。
  5. 按500ul异丙醇/ml Trizol 的比例加入异丙醇,用手震荡一下,1530℃(室温即可)孵育10min。28℃,12000g,离心10min,弃上清,RNA沉于管底。按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,漩涡混匀,悬浮沉淀。(注:75%乙醇用DEPC水配制)
  6. 4℃,7500转离心5min,尽量弃尽上清(注:用完离心机关电源后,将离心机盖打开30分钟降温,再盖上)室温晾干或真空干燥5~10min。(注:不能用离心的方法使RNA干燥,RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。)
  7. 1×RNAsafe30 ul(或1‰DEPC水30ul)溶解RNA沉淀,60℃水浴20min(**注:**用蒸馏水配置1/100的DEPC水高压后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀释)测OD值定量RNA浓度(用DU800紫外光度计测量)如果提取的RNA不进行逆转录可在-80℃保存

第二步 RT-PCR操作步骤

一、RNA逆转录cDNA(反应体系要20ul)依次加入

1、Oligo(dT)加入1ul。

2、RNA(体积即上一步骤计算出来的)

3、剩下的用无Rnase水补齐共12ul 65℃水浴5min。

二、加入逆转录试剂

1、5×Reaction Buffer 4ul

2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul

3、10mM Dntp mix 2ul

4、RevertAid m-mul URT 1ul

三、设置仪器,按照说明书设置

1、oligodT:42℃ 60min

2、逆转录:70℃ 5min

3、终止:4℃

附加:cDNA可以跑电泳看一下,取cDNA 1ul加load buffer(看这个是几乘的)混匀,跑电泳,marker用2000的取6ul左右胶板的制作,后面有说明。

四、PCR cDNA扩增目的基因(反应体系是20ul,不够用无菌水补齐)

下面的实验用高压过的枪头和普通高压过的水即可。(所用以下配比物品都要在冰箱中冻存,使用之前离心,甩下来即可。量大的话可以先加样配比,即把所需要的试剂总量计算出后,取出放在ep管中。)

1、加样:①Mix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水总计9ul

2、混匀:小离心机甩一下即可

3、放入PCR仪:PCR仪事先设定条件,反应条件根据mix说明书来设定

4、PCR产物保存:一般在4℃冰箱保存,长时间不用可-20℃冻存。

五、配胶和跑胶:

1、配胶: (水平胶;琼脂糖凝胶)要带手套,TAE有毒。

小胶板8孔的 TAE 25ml 琼脂糖 0.25~0.30g

中胶板25孔的 TAE 50ml 琼脂糖 0.50~0.55g

步骤:称取BIOWEST AGAROSE(琼脂糖)放入配胶专用烧瓶→用配胶专用量筒量1×TAE倒入烧瓶→酒精灯加热(以看到冒泡为准)→将沸腾的液体转移到EB污染区的烧瓶中→加入EB或EB替代(观察颜色不是很深即可,一般小胶板3滴左右)→插梳子→倒入电泳槽(倒胶从一个角倒入防止产生气泡)→待胶凝固30分钟左右拔出梳子进行跑胶(如不马上跑将胶放4℃冰箱保存,防止胶变干)。

2、跑胶:

(1)电泳缓冲液用1×TAE,一般跑5-8次胶后就要重新换电泳缓冲液。

(2)要让缓冲液没过胶。

(3)Marker标记染色体上一个可以被识别的区域,我们用的是2000的(保存在4℃冰箱中):3-6ul单格加入。

步骤:取PCR产物(cDNA)8ul,加入单格上,接通电源,跑胶。(注意:跑胶方向是从负极到正极),当loading Buffer跑到2/3时停止跑胶(大约40分钟),带手套取胶放在照相台上。

六、照相

注意事项

1、组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol 用量

2、组织或细胞量过多,会引起DNA对RNA的污染

3、高蛋白、高脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆后须2-8℃,12000g离心5min去除不溶物,再进行下面操作,若上层有脂肪物,则也须去除。

4、热天提RNA,戴手套是必须的,手是Rnase的主要来源。

5、匀浆时,组织块不宜过大,先用组织剪将组织剪碎,然后再充分匀浆。

6、对实验器具进行处理。主要有以下几点,(1) 研磨过程使用的研钵需要高温干燥处理后使用。(2) 实验中使用的EP管,枪头等塑料制品,需要用DEPC水浸泡24小时后,经高温灭菌干燥使用。(3) 为了防止Rnase的污染,用DEPC水替代三蒸水进行溶液的配制。(4) RNA操作中使用专用的器械,有条件的也可以设置专用实验室。

7、外源性的RNase会污染玻璃、塑料制品、实验器械、及各种实验试剂。操作过程中,手套是最容易污染样品的,因此手套要勤换。实验人员说话过程中所带的唾液会降解样品,故需带口罩操作。在RNA整个提取过程中,实验人员熟练快速的完成整个RNA的提取,减少实验所用的时间。

实验准备以及所用试剂

1.trizol试剂

2.氯仿(三氯甲烷)

3.异丙醇

\4. 75%乙醇(DEPC水配制)

\5. RNA酶灭活剂

\6. 逆转录试剂

\7. DEPC水

8.无水乙醇

9.2000的marker

10.琼脂糖

11.EB替代

12.小镊子

13.大小EP管架

14.注射器

15.手套,口罩

16.移液枪

17.DEPC水泡过的枪头

试剂的保存

\1. 氯仿又叫三氯甲烷,一般储存在4℃冰箱中

\2. trizol试剂,2到8℃保存

\3. cDNA -80℃保存

\4. RNAsafe -20℃保存

\5. 2X power Taq PCR MasterMix -20℃保存

\6. 逆转录试剂 -20℃保存

\7. PCR产物保存:一般在4℃冰箱保存,长时间不用可-20℃冻存。