Lum's Notes

实验前的准备

用超净台，用之前开紫外照射，把RNAase free水，需要管，大中小枪头，镊子，和板子。

放入超净台，不吹风，用镊子装枪头，摆EP管。

3大步：裂解Trizol 萃取CHCL3 （氯仿） 沉淀异丙醇

第一步 RNA的提取

1. 从液氮中取出组织后，快速的拿到超净台上，放入小皿中，加入trizol试剂，（100mg的组织放入1.2ml的trizol试剂），用注射器进行研磨，注意要熟练，快速研磨。（下面加的试剂按照1ml trizol的比例添加即可）。
2. 细胞或组织加入Trizol研磨后，15~30℃孵育15min，使其充分裂解。(此时如果不接着做下面的实验可以冻存于-80℃低温冰箱)。
3. 4℃，12000转，离心5min ,弃沉淀。（超净台准备好EP管，离心后，吸取上清至准备好的EP管中）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈振荡15s,（用手震荡即可）15_30℃孵育23min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。（氯仿又叫三氯甲烷chloroform，一般储存在4℃冰箱中）。
4. 4℃，12000转,离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。注：（1）吸取水相要小心，千万不要吸取中间界面。可采用小枪头少量多次吸取（2）若同时提取DNA和蛋白质，则保存下层有机相，存于4℃冰箱内备用，否则弃下层有机相。
5. 按500ul异丙醇/ml Trizol 的比例加入异丙醇，用手震荡一下，15_{30℃（室温即可）孵育10min。2}8℃，12000g,离心10min,弃上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇／ml Trizol加入75％乙醇，漩涡混匀，悬浮沉淀。（注：75％乙醇用DEPC水配制）
6. 4℃，7500转离心5min，尽量弃尽上清（注：用完离心机关电源后，将离心机盖打开30分钟降温，再盖上）室温晾干或真空干燥5~10min。（注：不能用离心的方法使RNA干燥，RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）
7. 1×RNAsafe30 ul（或1‰DEPC水30ul）溶解RNA沉淀,60℃水浴20min（**注：**用蒸馏水配置1/100的DEPC水高压后才能用,20×RNAsafe 用DEPC水稀释）测OD值定量RNA浓度（用DU800紫外光度计测量）如果提取的RNA不进行逆转录可在-80℃保存

第二步 RT-PCR操作步骤

一、RNA逆转录cDNA（反应体系要20ul）依次加入

1、Oligo（dT）加入1ul。

2、RNA（体积即上一步骤计算出来的）

3、剩下的用无Rnase水补齐共12ul 65℃水浴5min。

二、加入逆转录试剂

1、5×Reaction Buffer 4ul

2、Ribolock RNase Inhibiter 1ul

3、10mM Dntp mix 2ul

4、RevertAid m-mul URT 1ul

三、设置仪器，按照说明书设置

1、oligodT：42℃ 60min

2、逆转录：70℃ 5min

3、终止：4℃

附加：cDNA可以跑电泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看这个是几乘的）混匀，跑电泳，marker用2000的取6ul左右胶板的制作，后面有说明。

四、PCR cDNA扩增目的基因（反应体系是20ul，不够用无菌水补齐）

下面的实验用高压过的枪头和普通高压过的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中冻存，使用之前离心，甩下来即可。量大的话可以先加样配比，即把所需要的试剂总量计算出后，取出放在ep管中。）

1、加样：①Mix 10ul ②引物 1ul ③cDNA和水总计9ul

2、混匀：小离心机甩一下即可

3、放入PCR仪：PCR仪事先设定条件，反应条件根据mix说明书来设定

4、PCR产物保存：一般在4℃冰箱保存，长时间不用可-20℃冻存。

五、配胶和跑胶:

1、配胶: （水平胶；琼脂糖凝胶）要带手套，TAE有毒。

小胶板8孔的 TAE 25ml 琼脂糖 0.25～0.30g

中胶板25孔的 TAE 50ml 琼脂糖 0.50～0.55g

步骤：称取BIOWEST AGAROSE（琼脂糖）放入配胶专用烧瓶→用配胶专用量筒量1×TAE倒入烧瓶→酒精灯加热(以看到冒泡为准)→将沸腾的液体转移到EB污染区的烧瓶中→加入EB或EB替代（观察颜色不是很深即可，一般小胶板3滴左右）→插梳子→倒入电泳槽(倒胶从一个角倒入防止产生气泡)→待胶凝固30分钟左右拔出梳子进行跑胶(如不马上跑将胶放4℃冰箱保存,防止胶变干)。

2、跑胶:

（1）电泳缓冲液用1×TAE,一般跑5-8次胶后就要重新换电泳缓冲液。

（2）要让缓冲液没过胶。

（3）Marker标记染色体上一个可以被识别的区域，我们用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul单格加入。

步骤：取PCR产物（cDNA）8ul，加入单格上，接通电源，跑胶。（注意：跑胶方向是从负极到正极）,当loading Buffer跑到2/3时停止跑胶（大约40分钟），带手套取胶放在照相台上。

六、照相

注意事项

1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol 用量

2、组织或细胞量过多，会引起DNA对RNA的污染

3、高蛋白、高脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆后须2-8℃，12000g离心5min去除不溶物，再进行下面操作，若上层有脂肪物，则也须去除。

4、热天提RNA，戴手套是必须的，手是Rnase的主要来源。

5、匀浆时，组织块不宜过大，先用组织剪将组织剪碎，然后再充分匀浆。

6、对实验器具进行处理。主要有以下几点，(1) 研磨过程使用的研钵需要高温干燥处理后使用。(2) 实验中使用的EP管，枪头等塑料制品，需要用DEPC水浸泡24小时后，经高温灭菌干燥使用。(3) 为了防止Rnase的污染，用DEPC水替代三蒸水进行溶液的配制。(4) RNA操作中使用专用的器械，有条件的也可以设置专用实验室。

7、外源性的RNase会污染玻璃、塑料制品、实验器械、及各种实验试剂。操作过程中，手套是最容易污染样品的，因此手套要勤换。实验人员说话过程中所带的唾液会降解样品，故需带口罩操作。在RNA整个提取过程中，实验人员熟练快速的完成整个RNA的提取，减少实验所用的时间。

实验准备以及所用试剂

1.trizol试剂

2.氯仿（三氯甲烷）

3.异丙醇

\4. 75%乙醇（DEPC水配制）

\5. RNA酶灭活剂

\6. 逆转录试剂

\7. DEPC水

8.无水乙醇

9.2000的marker

10.琼脂糖

11.EB替代

12.小镊子

13.大小EP管架

14.注射器

15.手套，口罩

16.移液枪

17.DEPC水泡过的枪头

试剂的保存

\1. 氯仿又叫三氯甲烷，一般储存在4℃冰箱中

\2. trizol试剂，2到8℃保存

\3. cDNA -80℃保存

\4. RNAsafe -20℃保存

\5. 2X power Taq PCR MasterMix -20℃保存

\6. 逆转录试剂 -20℃保存

\7. PCR产物保存：一般在4℃冰箱保存，长时间不用可-20℃冻存。