IP
一、细胞裂解
1、转染后24-48 h收获细胞，用冷的PBS（4°C）洗细胞三次，最后一次吸干PBS；
2、加入适量（500μl）预冷的细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min；
3、用预冷的细胞刮将细胞从培养瓶上刮下，将裂解液收集到1.5ml EP管中，4°C、最大转速（14000rpm）离心30 min后取上清；
4、取少量（20μl）裂解液以备western blotting分析；
二、准备磁珠
5、将beads完全重悬；
6、吸取25μl beads到一个EP管中；（准备两份，一份结合抗体，一份去除非特异性蛋白）
7、将EP管放在磁力架上，将beads从溶液中分离出来，吸去上清；
8、再用预冷的lysis buffer 500μl洗三次，每次都用磁力架将beads分离出来，最后将EP管从磁力架上取下来；
三、结合抗体
9、取5μl的Antibody（His），加入到准备好beads的EP管中；
10、4°C旋转、孵育5h；
11、将EP管放在磁力架上，把beads-His复合物从溶液中分离出来，吸去上清；
12、用冷的lysis buffer 1000μl洗三次，最后一次尽量吸尽上清，再加入25μl的lysis buffer；
四、免疫共沉淀
13、在裂解好的细胞样品500μl（步骤3）中加入beads（步骤6）25μl中，4°C旋转2h（去除非特异性蛋白）；
14、将EP管放在磁力架上，收集上清；
15、将上清加入预处理的beads-His复合物中，轻轻重悬beads-His复合物；
16、4°C旋转、孵育2h，让Myc-His与beads-His复合物结合；
17、将EP管置于磁力架上，转移上清到一个新的EP管中，以备需要时进一步分析；
18、用1000μl的lysis buffer洗beads-His-Flag复合物三次，每次清洗后在磁力架上分离，移去上清，再温柔地重悬复合物；（Avoidco-elution of proteins bound to the tube wall）
四、洗脱目标蛋白
19、将EP管放在磁力架上，吸去上清；
20、加入20μl的2×SDS上样缓冲液，轻轻重悬beads-His-Flag复合物；
21、50°C加热10min；
22、将EP管放在磁力架上，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳。
注意事项：
（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而不是外源性的非特异蛋白。
这句话的含义是，你需要保证加入的抗体本身不会形成共沉淀、保证使用正常的IGg抗体作为抗体阴性对照、保证在不表达目标抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀、保证加入的抗体只结合目标抗原（抗原-抗体强特异性）。一个有效的手段就是使用特异性好的单克隆抗体，这就需要我们提前通过WB实验摸索出好用的抗体。总之，需要根据实际情况，充分设置对照，只有这样才能斩金截铁地说作出结论。
（2）需要确定蛋白间的相互作用是发生在活的细胞中，而不是由于细胞膜溶解后才发生的。
这句话的含义是如果不加入裂解液，我们加入了抗体，此时不会形成免疫共沉淀蛋复合物；同时，我们还必须通过免疫荧光双重标记做共定位分析，确定需要研究的蛋白质确实存在于细胞内，并且有共定位特征。
（3）细节，细节，细节。Co-IP的优点是能够在天然状态下分析但经翻译后修饰过的蛋白质之间的相互作用，排除了人为因素的干扰，同时还能分离这种复合物。如果整个实验论证充分，将会是一个很有力的证据。
\1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的。
\2. 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
\3. 使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
\4. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
\5. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。
\6. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定
Co-IP技术疑点分析
1、Co-IP可不可以用珠子做？比如HIs GST的琼脂糖？
答：Co-IP是通过磁珠与抗体形成的复合物进行富集，HIs GST的琼脂糖这些柱料不适用。
2、请问Co-Ip如何选择合适的Input对照和同型对照？有什么要求和原则吗？
答：Co-IP使用Input阳性对照即可，Input即实验使用的细胞裂解液。
3、互作验证一定要western吗？纯化的蛋白可见呢？
答：可见蛋白只能判断蛋白大小，还是需要WB确定就是目的蛋白。
4、Co-IP时，Input的带型不够亮，怎么解决？
答：可以瞬转过表达处理。
5、两个蛋白，哪个适合ip有要求吗？
答：有IP级别抗体的蛋白优先考虑作为诱饵蛋白。
6、请问Co-IP，INPUT的加样量是多少？那IgG和IP的上样量相应有要求吗？
答：通常上样量50ug/100ug。
7、免疫共沉淀如何避免假阳性？
答： Co-IP选择抗体尤为关键，特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高，则降低抗体浓度；若抗体特异性不好，则更换抗体。
作者：金开瑞生物
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