CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury
Joel G. Rurik, et al. Science (2022). PMID:34990237
Abstract
本文研究者开发了一种能特异性靶向T细胞的脂质纳米粒（Lipid nanoparticles, LNPs），该LNPs能递送包裹在其中的mRNA，从而生成瞬时**嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell, CAR-T cell）以逆转心肌纤维化****。**具体来说，研究者通过将靶向CD5的LNPs注射到心衰小鼠模型中来评估这种体内重编程的CAR-T细胞的功效。结果显示，编码CAR结构的mRNA能够被高效递送到T淋巴细胞中，该过程在体内产生了瞬时有效的CAR-T细胞。抗纤维化的CAR-T细胞表现出了胞啃作用（Trogocytosis），并且当它们在脾脏聚集时能够保留靶抗原。利用修饰mRNA靶向的LNPs进行治疗, 可减少心脏损伤后的纤维化并恢复心脏功能。可见，体内生成CAR-T细胞这种治疗模式有望治疗多种疾病。
Research Topic
心肌损伤可激活心脏成纤维细胞，导致心肌纤维化，进而影响心脏功能。现有的抗纤维化治疗的临床试验旨在延缓纤维化进程，效果甚微。因此，开发新型疗法以在心肌纤维化后逆转纤维化是彻底解决上述问题的关键。
Background
（1）心肌损伤后，成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein, FAP）在心肌纤维化过程中发挥重要作用。
（2）嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）具有胞啃作用，能够识别相应的抗原并进行内吞。
（3）该课题组先前已利用逆转录病毒构建的FAP CAR-T细胞来特异性消除心脏病模型小鼠心脏FAP蛋白和活化的成纤维细胞，显著减少心脏纤维化并改善心脏功能[1]。
（4）逆转录病毒来源的FAP CAR-T细胞能够在体内较长期存活，为了避免其干扰组织正常伤口愈合过程，可以将表达FAP CAR的mRNA靶向递送至T细胞内以生成一种瞬时抗纤维化CAR-T细胞。
Methodology
实验材料：
1.表达目的蛋白的mRNA的制备：FAP-CAR\GFP\Luciferase荧光素酶\Cre recombinase重组酶
2.LNP-mRNA包载物制备：CD5/LNP包载的mRNA，IgG、LNP包载的mRNA
3.病毒转导的FAP CAR-T制备 :FAP CAR-T,CAR-GFP-T
4.mRNA体外制备的FAP CAR-T：CD5/LNP-FAP CAR转染小鼠的T细胞,设置CD5的对照组IgG和FAP的对照组GFP
5.mRNA体内制备的FAP CAR-T:CD5/LNP-FAP CAR静脉注射心机纤维化模型小鼠，设置六个对照组（FAP\GFP\Luc）
6.逆转录病毒构建FAP CAR-T（已有文章）
7.细胞模型：HEK 293T，分别表达FAP和RFP标记的FAP
8.动物模型：Ai6 Cre报告小鼠 、心肌纤维化小鼠模型（血管紧张素和苯肾上腺素诱导）
实验思路：
1.体外实验：Flowcyto测定FAP CAR-T的转染效率、dose-dependent manner（时间依赖）、对293T的细胞毒作用、实时成像观察与RFP-FAP HEK 293T 的
2.体内实验: 逆转录病毒构建的CD5/LNP-FAP CAR静脉注射模型小鼠、逆转录病毒构建的CD5/LNP-GFP CAR-T静脉注射模型小鼠、mRNA体内构建的CD5/LNP-FAP CAR静脉注射模型小鼠，以上都是胞啃作用实验Trogocytosis。脾脏的免疫荧光分析看白髓区域。
3.治疗评价：mRNA体内构建的CD5/LNP-FAP CAR静脉注射模型小鼠，做超声心动图像和心脏组织学分析。
Protocol:
https://en.bio-protocol.org/cjrap.aspx?eid=10.1126/science.abm0594
Outcomes and Value
1.mRNA靶向递送技术能够在体外构建FAP CAR-T细胞。
2.在体内可将FAP CAR mRNA靶向递送至T细胞以构建FAP CAR-T细胞。
3.逆转录病毒构建/mRNA靶向递送的FAP CAR-T细胞在体内外能够发挥胞啃作用。
4.治疗评价：接受治疗的动物的心脏重量与体重比在统计学上有显著改善，体内生成的FAP CAR-T细胞能够降低损伤心肌的纤维化并改善心脏功能。
Conclusion
CD5/LNP-FAP CAR-T→T cells→ FAP CAR-T →Trogocytosis →FAP 下降→Activated cardiac fibroblast 下降 →Fibrosis 下降
本研究利用靶向CD5的LNPs将FAP CAR mRNA特异性递送至心肌损伤小鼠T细胞，生成的FAP CAR-T细胞能够通过胞啃作用逆转小鼠损伤心肌的纤维化并改善心脏功能。
未来课题
mRNA靶向递送技术和CAR-T细胞技术均是当今研究热点，分别在新冠疫苗研制和肿瘤治疗方面取得了巨大成功。本研究将上述两项技术进行结合，首次利用mRNA在体内生成CAR-T以治疗心肌纤维化，极大地开拓了相关研究领域。
能否用靶向型的LNPs递送mRNA在体内构建CAR-T、TCR-T、CAR-NK等免疫细胞，用于肿瘤治疗
Ref
\1. Aghajanian H, Kimura T, Rurik JG, et al. Targeting cardiac fibrosis with engineered T cells. Nature, 2019, 573:430-433.
\2. Etienne Joly and Denis Hudrisier. What is trogocytosis and what is its purpose? Nature Immunology, 2003, 4:815.
\3. Nuria Martínez-Martín, Elena Fernández-Arenas, Saso Cemerski, et al. T Cell Receptor Internalization from the Immunological Synapse Is Mediated by TC21 and RhoG GTPase-Dependent Phagocytosis. Immunity, 2011, 35(2): 208-222.
\4. Mohamad Hamieh, Anton Dobrin, Annalisa Cabriolu, et al. CAR T cell trogocytosis and cooperative killing regulate tumour antigen escape. Nature, 2019, 568, 112–116.