3D-organoid culture supports differentiation of human CAR+ iPSCs into highly functional CAR T cells

Wang, Zhiqiang, et al.Cell stem cell (2022). PMID: 35395190.

Abstract

本研究通过开发三维类器官培养体系，成功开发了从iPSCs产生高活性CAR T细胞的高效新策略

Research Topic

开发有效的CAR-T制作工艺是目前CAR-T临床转化的关键问题。结合iPSCs工程技术和3D-类器官培养体系，可制备出具有更强功能的CAR T细胞。

Background

（1）先前已证实iPSC细胞可诱导分化为具有γδ T细胞特征和部分CAR T细胞功能的细胞。

（2）已有成功使用3D-类器官培养系统诱导造血干细胞和胚胎干细胞转化为功能成熟T细胞的研究报道。（3）进一步可考虑通过3D-类器官培养系统诱导iPSC生成功能成熟的CAR T细胞。

Methodology

构建：

3D类器官培养体系诱导iPSC分化扩增位CAR-T：用CD19 CAR的慢病毒转导iPSC，在基于胚胎和iPSC的人工胸腺类器官（PSC-ATO）系统诱导CD19 CAR 的iPSC分化为T细胞(需要5-7周)。

使用改良的快速扩增法（REM），实验组和Mock组PSC-ATO分化的iPSC T细胞大约在2周内实现了75倍的扩增。最终，从106个CAR+iPSC细胞中可生产出6×109个CD19-CAR T细胞，说明三维培养体系诱导扩增的CAR-T细胞数量可满足临床使用的要求。

表型鉴定：

1.CAR-T表面标记物的流式鉴定：流式，CD3/CD5/CD7/TCRαβ/CD8αβ阳性和NKG2A/NKP46/CD16/CD19阴性的表型。

2.和传统CAR-T亚群的比较：类似，由处于不同分化阶段的群体组成的。

3.CAR-转基因水平的测定：由iPSC 衍生的T细胞均保留了它们的TCR单克隆，而传统T细胞产品则是高度多克隆的。

转录表达分析：

1.RNA深度测序：iPSC来源的 T细胞的转录谱与传统来源的T细胞或来自同一供体的NK细胞相似，且更接近传统T细胞

2.差异基因筛选与传统免疫细胞分析对比：IL-13、HLA-DR、IL7R、CCR4和CD74的表达水平较低，但DLL1、FOSL2、TXK、REG4和IFITM2水平较高。相关功能基因集分析显示，与传统的CD19-CAR T细胞相比，iPSC CD19-CAR T细胞表达的T淋巴细胞基因CD3E、CD3D、CD8、LCK和ZAP70的水平较高，CD4、GATA3、BCL11B和LEF1基因的水平较低。在细胞毒基因方面，iPSC CD19-CAR T细胞表达更多的GNLY和PRF1，但GZMB较少。T细胞抑制基因上，iPSC CD19-CAR T细胞表达较少的CTLA4、PD1和TIGIT，但表达较多的LAG3和TIM3。

3.转录启动子甲基化检测：EF1α启动子的甲基化状态检测

功能验证：

iPSC CAR-T细胞体外和体内抗肿瘤功能的验证：

体外效应功能：细胞的定向溶解、脱颗粒性和IFN-γ水平
信号转导：信号通路WB分析，iPSC CD19CAR T细胞表现出ERK1/2 Thr202/Thr204和PLCγ Ser1248的磷酸化，说明其抗原特异性与传统CD19-CAR T细胞相当。
抗肿瘤疗效：小鼠腹膜内急性淋巴瘤肿瘤模型，静脉注射iPSC CD19-CAR T细胞治疗显著地延缓了肿瘤的进展，并明显延长了小鼠的生存期。和人IL-15分泌型细胞（NS0-hIL15）联合治疗增强效果。

Outcomes and Value

该系统产生的 iPSC CD19-CAR T细胞与传统的CD19-CAR T细胞相比，显示出相当的抗原特异性激活、脱颗粒、细胞毒性和细胞因子分泌，并显示在体内强大的抗肿瘤活性，延长了CD19+人肿瘤异种移植小鼠的生存期。

Lum's Notes